添加生香酵母改善醬油風味的研究

傳統的醬油釀造以大豆、小麥為原料，經過天然曬制而成。產品的醬香及酯香突出，但發酵周期長，設備利用率低，還受季節環境的影響限制，目前占國內醬油的比例很小^[1-2]。我國醬油主要采用低鹽固態發酵工藝，也有部分醬油采用低鹽稀態發酵工藝^[3]。這兩種工藝雖然具有發酵周期短（15—25d）、原料蛋白利用率高和生產成本低等優點，但其發酵溫度高，不利于酵母菌的生長、繁殖，以致生產的醬油風味香氣不足^[1]。

醬油的風味與多種微生物有關，其中醬油酵母對其風味的形成有重要影響^[1]。從傳統醬油醪分離出來與醬油質量密切有關的酵母主要是魯氏酵母和球擬酵母，其在醬油釀造過程中賦予了醬油醇香、酯香等風味物質^[1，4-5]。為了提高醬油的風味，有的醬油廠在發酵后期添加醬油酵母，取得了良好效果^[6-9]。本研究在陳強^[9]探索的低鹽稀態發酵醬油生香發酵工藝的基礎上，在低鹽稀態發酵醬油中添加2株耐鹽醬油酵母進行發酵，通過比較分析醬油生香發酵前后主要理化指標和揮發性風味成分的變化差異，為應用醬油酵母生香發酵技術，以改善低鹽稀態發酵醬油的風味提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

生醬油—低鹽稀態發酵醬油，酵母JM01和JM06：李錦記（食品）有限公司；

氫氧化鈉、甲醛、鹽酸、葡萄糖、重鉻酸鉀、乙醇（分析純）：中國醫藥（集團）上海化學試劑公司。

1.2儀器與設備

UV1100紫外可見光分光光度計：北京萊伯泰科儀器有限公司；PAL—a Brix計：日本ATAGO公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋：常州普天儀器制造有限公司；794全自動滴定儀：瑞士萬通（中國）有限公司；TRACE GC-MS-2000氣相色譜-質譜聯用儀：美國Thermo Finnigan公司；HP-INNOWAX毛細管柱：上海笛柏實驗設備有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1低鹽稀態發酵醬油酵母生香發酵工藝流程

低鹽稀態發酵醬油酵母生香發酵工藝參考陳強^[9]的研究，并進行優化。

1.3.2生醬油調配標準

調配低鹽稀態發酵醬油的NAC1含量為12%-14%，氨基酸態氮含量為0.8-0.9g/100mL，總酸含量為2g/100mL左右，可溶性固形物含量為28%-30%，PH值為4.5-5.0，還原糖含量為1.8-2.0g/100mL。

1.3.3添加酵母靜置生香發酵

調配好的低鹽稀態醬油接種醬油酵母，JM06接種量為4%（V/V）JM06與JM01的接種比例為1：1，發酵溫度為30℃，發酵時間為7d。

1.3.4常規指標測定

氨基酸態氮（amino acid nitrogenAN）、總酸均按國標GB 18186—2000《釀造醬油》中規定測定；還原糖按國標GB/T5009.7—2008《食品中還原糖的測定》中方法測定；固形物采用Brix比重計測定；總酯含量測定：連續電位滴定法；酒精含量測定：重鉻酸鉀比色法。

1.3.5醬油揮發性成分測定

固相微萃取：取樣品30mL密封于100mL頂空樣品瓶，置于40℃水浴中電磁攪拌，固相微萃取纖維頂空萃取40min250℃解吸3min后進樣。

氣相色譜分析條件：HP-INNOWAX毛細管柱（30mm×0.25mm）;載氣He，流速1.0mL/min;程序升溫，起始溫度45℃保持5min，升溫速率5℃/min溫度至200℃，保持15min升溫速度10℃/min*終溫度220℃，保持5min；汽化室溫度220℃，進樣量0.8uL。

質譜分析條件：電子電離（electron ionizationEI）源，電子能量70eV，發射電流200uA，電子倍增器電壓350V，離子源溫度200℃，質量掃描范圍35-335amu。

數據處理：試驗數據處理由Xcalibur軟件完成，在美國國家標準與技術研究院（national institute of standards and technologyNIST）譜庫（107 000個化合物的數據）和Wiley譜庫（320 000個化合物的數據，Version6.0）對未知化合物進行檢索并計算匹配度，只有當正反匹配度均大于800（*大值為1000）時才能確證該物質。

2結果與分析

2.1低鹽穩態醬油生香發酵前后主要理化指標比較

根據陳強^[9]的研究，采用酵母生香發酵*優工藝對低鹽穩態發酵生醬油進行生香發酵，發酵結束后取樣測定其總酸含量、氨基酸態氮含量、總酯含量、酒精含量、可溶性固形物含量和還原糖含量，與生香發酵前的原低鹽稀態發酵醬油進行對比。

低鹽稀態發酵醬油生香發酵后總酸、總酯、酒精含量明顯提高，可溶性固形物、還原糖含量基本保持不變，氨基酸態氮含量有略微降低。

感官評價方面，生香發酵后的醬油酯香、醇香濃郁，香氣柔和，風味得到了較大的改善。結果表明，醬油酵母在低鹽稀態醬油得到 良好的繁殖代謝，產生的醇類、酯類和有機酸類等物質增加了醬油風味，并在一定程度上降低了原醬油的不良氣味。增香后風味評價結果與李琴等^[10]的研究結果一致，即酵母菌的添加明顯改善醬油風味。

2.2低鹽 稀態醬油生香發酵前后揮發性風味成分比較

采用固相微萃取技術對醬油揮發性成分進行提取，并利用氣-質聯用法進行測定，低鹽稀態發酵醬油生香發酵前后的主要揮發性風味成分的質譜。

生香發酵后的醬油與原低鹽稀態發酵醬油相比，其揮發性成分出現了顯著的差異，物質的種類的含量差異（峰面積歸一法）。

原低鹽稀態發酵醬油生香發酵后的醇類、酯類、醛類、酸類、酚類和其他化合物等6類主要揮發性成分在種類和含量上都產生明顯的變化，特別是醇類、酯類這兩類物質在揮發性成分中的比例明顯提高。

2.2.1醇類化合物

原低鹽稀態發酵醬油檢測出7種主要醇類物質，醬油生香發酵后檢測到8種，新增的醇類物質為苯甲醇和4-異丙烯基-5-甲基-4-乙烯基-1-醇，減少的醇類物質為異辛醇。

原醬油添加生香酵母發酵后，醬油中的醇類物質在揮發性成分中的比例由43.76%提高至64.95%，總含量明顯提高。其中，苯乙醇由生香發酵前的0.55%增加至0.75%。其均是傳統釀造醬油的特征香氣成分，苯乙醇是酵母菌的代謝產物，來源于酒精發酵過程中苯丙氨酸的降解，具有du特的紫羅蘭香、丁香、茴香味、蜂蜜味及青甜玫瑰的氣息，而3-甲硫基-1-丙醇在濃度較低時即有強烈的肉湯香味^[11-12]。

2.2.2酯類化合物

原低鹽稀態發酵醬油中檢測出4種酯類物質，醬油生香發酵后檢測出6種，新增加的物質為乙酸異戊酯和醋酸苯乙酯。

原醬油生香發酵后，酯類物質在揮發性成分中的比例由0.99%增至12.08%，在種類和百分含量上均有了顯著的增加。其中乙酸異戊酯和醋酸苯乙酯的升幅*大，分別由生香發酵前的0%和0.31%上升至6.19%和5.52%。乙酸異戊酯具有較強的新鮮果香、稍甜，有類似熟香蕉、生梨和蘋果的香味，醋酸苯乙酯具有桃子香氣，這兩種物質百分含量的大幅上升對醬油風味的改善起到了重要的作用。酯類物質提高的主要原因是酵母發酵過程中產生的酯化酶對有機酸類與醇類進行酯化作用，這也是揮發性酸類物質含量下降的主要原因^[13-15]。

2.2.3醛類化合物

醬油生香發酵前后均檢測出8種醛類物質，其中相同的成分有7種，分別為壬醛、糠醛、癸醛、苯甲醛、苯乙醛、a-亞乙基-苯乙醛和茴香醛，醬油生香發酵后新增了肉桂醛，減少了辛醛。醛類物質在揮發性成分中所占的比例明顯降低，由10.08%下降為4%。醛類物質一般不是醬油的特征風味成分，但其能夠與醬油酵母代謝產生的醇類或硫化物反應，提高醬油風味^[1]。

2.2.4酸類化合物

原低鹽稀態發酵醬油中檢測出5種揮發性酸類物質，醬油生香發酵后檢測到7種，其中相同的酸類物質有醋酸、丁酸、戊酸和4-甲基戊酸，新增加的酸類物質為反-2-乙烯基環戊烷羧酸、辛酸和癸酸，減少的酸類物質有異丁酸。酸類物質在揮發性成分中所占的比例也明顯降低，由14.45%下降為5.4%，特別是醋酸由10.65%下降為3.94%，表明低鹽稀態發酵醬油中的酸類物質與酵母代謝產物醇類物質發生了反應。另外，常規理化指標顯示醬油生香發酵后總酸由1.77g/100mL增至1.94g/100mL，表明了酵母在發酵過程中產生了非揮發性有機酸類物質，其主要來源酵母的三羧循環^[1]，而揮發性酸類物質由于酯化而降低。因此，酸類物質的變化促進了醬油風味的柔和。

2.2.5酚類各其他類化合物

醬油生香發酵前后均檢測出4種酚類物質，其中愈創木酚、4-乙基愈創木酚和4-乙基苯酚均是天然發酵醬油里特有的香氣物質，由于生香發酵時間短，此類風味物質變化不大。

其他類化合物包括吡嗪等含氮化合物、呋喃等含氧雜環化合物、噻唑等含硫化合物以及烴類化合物等，雖然這些物質的種類百分含量在醬油生香發酵后有所下降，但是這些化合物具有非常低的風味閾值，仍然對醬油的整體風味貢獻很大。

綜合表明，低鹽稀態發酵醬油添加生香醬油酵母發酵后，醇類和酯類這兩類物質在揮發性風味成分中的比例顯著提高，特別是異戊醇、3-甲硫基-1-丙醇、苯乙醇、乙酸異戊酯和醋酸苯乙酯等含量比例的提高大大改善了醬油的香氣；在生香酵母的作用下，醛類、酸類、醇類和其他類化合物形成醬油新的香氣成分，既減少一些不良風味，又促進醬油風味更加柔和。

3結論

低鹽稀態發酵醬油生香發酵后總酸、總酯、酒精含量明顯提高，分別由1.77g.100mL、7.84g/100mL和0.09%增至1.94g/100mL、9.85g/100mL和2.12%；可溶性固形物、還原糖含量基本保持不變，氨基酸態氮含量略微降低。

通過氣相色譜質譜用（gas chromatograph-massapectrometer，GC-MS）對低鹽稀態發酵醬油生香發酵前后的揮發性風味成分進行分析，醇類和酯類物質在揮發性風味成分中的比例由原來的43.76%和0.99%分別提高至64.95%和12.08%；醛類和酸類物質由10.08%和14.45%分別下降為4%和5.4%。